Dois softwares inovadores desenvolvidos por pesquisadores da Unesp no câmpus de Botucatu têm apoiado pesquisas que buscam entender como a genética pode influenciar o funcionamento do sistema imunológico humano. Produto de um trabalho que vem sendo realizado há quase dez anos no Laboratório de Genética Molecular e Bioinformática (GeMBio) da Faculdade de Medicina de Botucatu (FMB), os programas hla-mapper e kir-mapper permitem uma análise detalhada das moléculas HLA (Antígeno Leucocitário Humano) e dos receptores KIR, estruturas fundamentais para a defesa do nosso organismo, mas cujo sequenciamento ainda é um desafio para pesquisadores da área de imunogenética.
Na dinâmica de funcionamento do nosso sistema imunológico, as moléculas HLA (Antígeno Leucocitário Humano), os receptores KIR e os linfócitos T (um subtipo de glóbulo branco) trabalham de forma coordenada para nos proteger da presença de microorganismos causadores de doenças, como vírus e bactérias. Enquanto os dois primeiros atuam na identificação de elementos invasores, o terceiro ataca as células infectadas ou anormais, como aquelas afetadas por tumores.
Para que nada passe despercebido por esse sistema de defesa, os genes que produzem as moléculas HLA e os receptores KIR foram sendo modificados ao longo do processo evolutivo, e originaram diversas versões dessas sentinelas, capazes de identificar uma infinidade de micro-organismos. Isso quer dizer que cada ser humano pode apresentar uma combinação diferente dessas estruturas, o que lhe confere uma identidade imunológica própria.
Respostas imunológicas diversas, mas com DNA similar
Essa variedade confere uma proteção genética fundamental, uma vez que impede que um único vírus ou bactéria que consiga furar essa barreira acabe eliminando toda uma população. Por outro lado, ela também torna difícil a doação de órgãos e medulas ósseas, já que o mecanismo de defesa pode identificar o órgão como um invasor a ser combatido. É o que chamamos de rejeição. Do ponto de vista da pesquisa em biologia molecular, explica o biólogo Erick da Cruz Castelli, coordenador do grupo GeMBio, essa variedade nas respostas imunológicas contrasta com códigos genéticos bastante similares, característica que impõe alguns desafios ao estudo dessas moléculas. “A sequência de DNA desses genes é muito parecida, apesar das diferenças que promovem essa diversidade na resposta imunológica. Por conta dessa diferença, hoje, as técnicas que temos para conseguir analisar e sequenciar esse DNA exigem uma atividade computacional intensa”, afirma o pesquisador do Departamento de Patologia da FMB.
Em um esforço para facilitar esse trabalho de sequenciamento, os pesquisadores começaram, em 2018, o desenvolvimento do software hla-mapper, para a análise das moléculas HLA. Criado em código aberto e com acesso gratuito, o programa é uma alternativa aos kits disponibilizados atualmente no mercado para esse tipo de análise. “Os kits comerciais funcionam muito bem e são os mais utilizados, por exemplo, na preparação de transplantes. Entretanto, para uso em pesquisas, eles são extremamente caros, uma vez que estamos falando de projetos que muitas vezes demandam a caracterização de milhares de indivíduos em diferentes partes do mundo”, esclarece Castelli. Além disso, segundo o pesquisador, a análise feita por meio dos kits comerciais é mais limitada. “Como o foco do produto são os transplantes, esses kits acabam não analisando o gene por inteiro. Partes que não são relevantes para o transplante não são incluídas. Em um projeto de pesquisa, entretanto, precisamos da análise completa porque em geral buscamos entender como esses genes evoluíram. Nesse contexto, nosso grupo precisou desenvolver um método que permitisse essa análise ampliada”, explica.
Resultado de uma série de projetos de doutorado orientados por Castelli, o hla-mapper hoje permite caracterizar regiões maiores dos genes, receber dados de diferentes origens e analisar os genes associados às moléculas HLA em milhares de amostras ao mesmo tempo. O usuário necessita apenas de um computador com sistema operacional Linux e, a depender do número de amostras trabalhadas ao mesmo tempo, de um servidor compatível.
Aplicações do hla-mapper pelo mundo
Ao longo do período de desenvolvimento, foram realizados diversos testes e atualizações do software. A versão mais recente disponível está em uso em pesquisas na Unesp, na USP, na Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre (UFCSPA), na Universidade Federal do Pará (UFPA) e no hospital Sírio Libanês. O programa também foi utilizado para caracterizar os genes responsáveis pela produção das moléculas HLA no estudo longitudinal Saúde, Bem-estar e Envelhecimento (SABE), que realizou o sequenciamento de genoma completo de 1.171 idosos da cidade de São Paulo.
Fora do país, o software vem sendo utilizado e reconhecido como importante ferramenta de análise dos genes associados às moléculas HLA. Castelli cita o registro de acessos ao software por pesquisadores chineses que não identificaram suas instituições, pesquisadores italianos do Centro di Riferimento Oncologico di Aviano; da Universidade de Nantes e da Universidade de Paris, na França, da Faculté des Sciences de la Santé, no Benin, da Universidade de Toronto, no Canadá, e da Universidade de Berna,na Suíça.
Durante a pandemia de Covid-19, o grupo de pesquisa de Castelli, em parceria com pesquisadores da USP, também fez uso de uma versão inicial do hla-mapper para investigar a resposta imune de idosos que não desenvolviam a doença. “Foi o nosso programa que fez toda a análise e permitiu a publicação de artigos, na época, trazendo a relação entre a Covid-19 e alguns genes do complexo HLA. Isso só foi possível por intermédio do nosso software, porque nenhum outro conseguiria analisar esses dados naquele período”, afirma o pesquisador.
Para Castelli, entre as principais contribuições do software estão a possibilidade de reunir amostras dos genes HLA do mundo todo e construir um banco de dados, uma vez que os genes são variáveis entre as populações de diferentes países e até mesmo dentro de um mesmo país, como é o caso do Brasil, que conta com uma população altamente miscigenada. Para o pesquisador, a inovação desenvolvida na Unesp tem o potencial de ampliar as oportunidades de pesquisa. “Com esse software, um grupo localizado em um país com poucos recursos conseguiria estudar esses genes e oferecer um retorno à população, seja em um estudo de associação e prevenção de doença, seja na parte de transplante. É possível produzir tudo em laboratório sem depender de importação de kits comerciais”, afirma.
Imagem de uma lâmina de sangue mostra os leucócitos (glóbulos brancos) entre as hemácias, as manchas numerosas de cor rosada (Crédito: Depositphoto)
Kir-mapper, o “software-irmão”
A partir da experiência com o hla-mapper, os pesquisadores iniciaram o desenvolvimento de um novo software, o kir-mapper. “Os dois softwares possuem uma base muito parecida, foram integralmente produzidos na Unesp, mas possuem focos diferentes. Enquanto um se dedica à análise dos genes produtores das moléculas HLA, o outro está focado nos genes que produzem os receptores KIR”, explica Castelli.
Os receptores KIR fazem parte de um segundo recurso do sistema imunológico para lidar com microrganismos nocivos ao corpo humano. Em algumas situações, quando bactérias ou vírus tentam inativar as moléculas HLA e impedir o seu alerta para os linfócitos T, entram em ação as células natural killers (NK). Essas estruturas também têm a função de atacar as células infectadas, mas contam com outro tipo de sentinela: os receptores KIR (do inglês Killer Cell Immunoglobulin-like Receptors ou Receptores do tipo imunoglobulina de células exterminadoras naturais). “Se a célula está produzindo as moléculas HLA normalmente, as células NK ficam quietinhas. Mas, se os receptores KIR não conseguem encontrar as moléculas HLA na superfície celular, é porque há algo de errado. Então os receptores KIR ativam as ‘exterminadoras naturais’ para eliminar a célula que não está apresentando HLA. Esse é um segundo recurso que o nosso sistema imunológico tem para lidar com a presença de um micro-organismo”, explica Castelli.
Assim como seu “software-irmão”, o kir-mapper também é gratuito, produzido em código aberto e permite a análise de milhares de amostras ao mesmo tempo. Portanto, segue o mesmo princípio de favorecer a democratização da ciência. “Temos a informação de que o programa já está em uso por pesquisadores no Brasil e no exterior, mas são indicações indiretas de uso, pois o programa é recente e ainda vamos publicar os resultados do desenvolvimento do software”, afirma o pesquisador. Apesar de ainda não ter sido oficialmente “revelado”, os pesquisadores do GeMBio tiveram uma amostra da receptividade do software durante o 19º International HLA & Immunogenetics Workshop, um importante evento da área realizado em maio, no Japão. Segundo Castelli, o recém criado kir-mapper foi citado diversas vezes pelos participantes como uma metodologia de análise eficiente dos genes associados aos receptores KIR.
A partir de agora, com os dois softwares rodando no laboratório do câmpus de Botucatu, os pesquisadores do GeMBio devem se dedicar à aplicação do programa em diferentes frentes de investigação. Uma das iniciativas está relacionada ao projeto temático Genômica Populacional Humana: uma perspectiva a partir de populações miscigenadas, financiado pela Fapesp. “Neste projeto, nós queremos entender, especificamente no caso do Brasil, como a miscigenação influencia a diversidade desses genes na nossa população. De forma aplicada podemos investigar, por exemplo, como a miscigenação influencia na chance de se encontrar um doador de órgãos compatível. É um projeto temático, financiado pela Fapesp em parceria com a USP, mas que usa os programas desenvolvidos na Unesp”, finaliza o pesquisador.
Imagem acima: pedestres caminham pela rua da cidade (Crédito: Depositphotos)